1　HPLC分析の概念/ HPLC分析的概念

HPLCとはHigh Performance Liquid Chromatographyの略で、日本語では高速液體クロマトグラフと呼びます。なお、クロマトグラフィーは測定方法、クロマトグラムは測定結(jié)果、クロマトグラフは裝置を指します。Tswettの実験で使用したオープンカラムは、技術(shù)の発展によって専用のカラムが開発されました。一定の速度でカラムに液體を送液するポンプも開発され、一つの分析システムとして高性能化したことで、High Performance Liquid Chromatography（HPLC）と表記されるようになりました。簡単にはLCと記載されることもあります?，F(xiàn)在は、さらに高性能化が進(jìn)み、高速分析が可能になったUltra high performance liquid chromatography（UHPLC）も用いられています。HPLCの分析対象は液體中に溶解している成分です。液體試料に溶解している化合物を分離し、どのような成分がどれくらい含まれているかを定性?定量分析することができます。図1に、HPLCの概念を示します。HPLCの分析で、液體試料內(nèi)の成分を分離のために流す液體を移動相と呼びます。移動相は送液ポンプにより、カラム（固定相）から検出器へ一定速度で流れていきます。複數(shù)の成分が混合した試料をカラムに注入し、カラム內(nèi)で分離します。カラム出口に設(shè)置した検出器でモニターし、成分を定性?定量分析します。

HPLC是High Performance Liquid Chromatography的縮寫，日語中稱為高速液相色譜儀。注意，色譜是指測定方法，色譜圖是指測定結(jié)果，色譜儀是指設(shè)備。隨著技術(shù)的進(jìn)步，Tswett 實(shí)驗(yàn)中使用的開放式柱已被專用柱所取代。還開發(fā)了一種泵，用于以恒定的速度將液體輸送到色譜柱，并且系統(tǒng)的性能得到提高，直到被稱為高效液相色譜法 (HPLC)。有時也簡稱為 LC。目前正在使用的超高效液相色譜法 (UHPLC) 更加復(fù)雜，可以進(jìn)行高速分析。 HPLC 的分析對象是溶解在液體中的成分?？梢苑蛛x溶解在液體樣本中的化合物，并進(jìn)行定性和定量分析，以確定存在哪些成分以及含量。圖 1 顯示了 HPLC 的概念。在 HPLC 分析中，承載液體樣品中成分并將其分離的液體稱為流動相。流動相通過泵以恒定的速率從色譜柱（固定相）流到檢測器。將含有多種成分混合物的樣品注入柱中，然后在柱中分離。使用安裝在塔出口的檢測器監(jiān)測各組分，并進(jìn)行定性和定量分析。

2　HPLCの裝置構(gòu)成/ HPLC設(shè)備配置

HPLCの概念（図1）ではHPLCの仕組みを模式図的に示しましたが、実際のHPLCは、送液ポンプ、脫気裝置、試料導(dǎo)入裝置、カラムオーブン、検出器およびデータ処理裝置といった様々なコンポーネントで構(gòu)成されています。図2にHPLCの裝置構(gòu)成の概略および各コンポーネントの役割を示します。

HPLC 概念（圖 1）顯示了 HPLC 的工作原理示意圖，但實(shí)際的 HPLC 需要各種組件，例如液體輸送泵、脫氣器、進(jìn)樣裝置、柱溫箱、檢測器和數(shù)據(jù)處理設(shè)備。它由以下組件組成：圖 2 顯示了 HPLC 系統(tǒng)配置概述以及各個組件的作用。

HPLCでは送液ポンプを用い、移動相を一定流量で送液します（a）。我々が生活している大気圧の條件下は移動相に気體が混入（溶存）しやすい環(huán)境です。気體が溶存した移動相を送液ポンプが吸引すると気泡が発生し、流量変動やベースラインのノイズ/ドリフトなどのトラブルが生じます。トラブルを防ぐため、送液ポンプの上流には脫気裝置を設(shè)置します(b)。 溶存気體が除去された移動相はカラムに送液され、試料導(dǎo)入裝置でカラムに導(dǎo)入します(c)。カラムでの成分分離は周囲の溫度変化の影響を受けます。周囲の溫度環(huán)境を一定にするため、カラムはカラムオーブン內(nèi)で溫調(diào)します(d)。カラムから溶出した成分は、カラム出口に設(shè)置した検出器でモニターします(e)。データ処理裝置は、検出器から送られてくる信號を処理して、クロマトグラムを出力し、定性、定量のためのデータ処理を行います(f)。このような流れでHPLC分析の結(jié)果が得られます。

在 HPLC 中，使用泵以恒定流速 (a) 輸送流動相。我們生活的大氣壓條件是氣體很容易混合（溶解）在流動相中的環(huán)境。當(dāng)泵吸入含有溶解氣體的流動相時，就會產(chǎn)生氣泡，從而引起流速波動和基線噪聲/漂移等問題。為了防止出現(xiàn)問題，在液體輸送泵（b）的上游安裝了一個脫氣裝置。除去了溶解氣體的流動相被送至色譜柱，并通過進(jìn)樣裝置（c）引入色譜柱中。塔中的組分分離受周圍溫度變化的影響。為了保持恒定的環(huán)境溫度，將柱子放入柱溫箱 (d) 中加熱。從色譜柱洗脫出的組分由安裝在色譜柱出口 (e) 處的檢測器監(jiān)測。數(shù)據(jù)處理單元對檢測器送來的信號進(jìn)行處理，輸出色譜圖，并進(jìn)行定性和定量分析的數(shù)據(jù)處理（f）。這就是獲得HPLC分析結(jié)果的方法。

3　HPLCにおける分離メカニズム/ HPLC 的分離機(jī)理

HPLCの使用により、さまざまな成分が分離できるのは、各成分がカラム內(nèi)を移動する速度が異なるためです。図3にHPLCにおける分離のメカニズムを示します。カラムの中では成分と移動相との相互作用（引き合う力）が強(qiáng)ければ、その成分は移動相の流れに乗ってカラムの中を速く移動し、早く溶出します。一方、固定相との相互作用が強(qiáng)ければ、移動相の流れに乗りにくいためカラムの中をゆっくり移動します。図3では、黃色の成分が移動相との相互作用が強(qiáng)く、早く分離?溶出され、ピンクの成分が固定相との相互作用が強(qiáng)く、遅く分離?溶出される、の例を示しています。このように、カラムの中を進(jìn)む各成分の速度の違いがHPLCにおける分離のメカニズムです。

使用 HPLC，可以分離不同的成分，因?yàn)槊糠N成分以不同的速率通過色譜柱。圖3顯示了HPLC的分離機(jī)制。如果色譜柱內(nèi)某種組分與流動相之間的相互作用（吸引力）強(qiáng)，那么該組分就會隨著流動相的流動而更快地流過色譜柱，從而更快地被洗脫出來。另一方面，如果與固定相的相互作用很強(qiáng)，它將不容易被流動相攜帶并會緩慢地穿過色譜柱。圖3所示的例子中，黃色組分與流動相相互作用強(qiáng)，較早分離和洗脫，而粉色組分與固定相相互作用強(qiáng)，較晚分離和洗脫。這樣，各個組分通過色譜柱的速度差異就是 HPLC 分離的機(jī)制。

4　クロマトグラムの読み方/4. 如何讀色譜圖

HPLCによる分離の結(jié)果を示すグラフをクロマトグラムといいます。図4にクロマトグラムの読み方を示します。カラムから何も溶出しないときには時間軸（橫軸）と平行な直線が描かれます。これをベースラインと言います。カラムの中で相互作用をした成分が溶出すると、ベースラインの上に山のような盛り上がりが現(xiàn)れます。これがピークです。カラムに成分が留まることを保持と呼び、分析のスタート（試料をカラムに注入）からピーク頂點(diǎn)までの時間を保持時間（tR）といいます。カラム內(nèi)で固定相と相互作用せず、カラムを素通りした時間を非保持の時間（t0）といいます。ピークの頂點(diǎn)から垂線を引いた時の距離をピーク高さ（h）、水色に塗りつぶされた部分の面積をピーク面積（A）といいます。これらの結(jié)果を用いて、試料成分の定性および定量に用います。

顯示 HPLC 分離結(jié)果的圖表稱為色譜圖。圖4顯示了如何讀取色譜圖。當(dāng)沒有任何東西從柱中洗脫出來時，會畫一條與時間軸（橫軸）平行的直線。這被稱為基線。當(dāng)與色譜柱相互作用的組分被洗脫時，基線上方就會出現(xiàn)山狀凸起。此為巔峰。組分在色譜柱中的保留時間稱為保留時間，從分析開始（將樣品注入色譜柱）到峰頂點(diǎn)的時間稱為保留時間（tR）。物質(zhì)通過色譜柱而不與色譜柱內(nèi)固定相發(fā)生相互作用的時間稱為非保留時間（t0）。從峰頂點(diǎn)引一條垂直線時的距離稱為峰高（h），淡藍(lán)色部分的面積稱為峰面積（A）。這些結(jié)果用于定性和量化樣品成分。